تازه‌های مالاریا و آزمایشگاه(۳) (بخش پایانی)

تستهای سرولوژیکی:
با این دسته تست‌ها بیماری‌را براساس تجسس آنتی‌بادی‌های ضد‌مرحله‌ی غیر‌جنسی انگل در خون تشخیص می‌دهند، آزمایش‌های ایمونوفلوئورسانس ‌IFA قابل‌اطمینان هستند و استفاده از آنها دردهه‌ی اخیر گسترش یافته‌است و درعین اینکه زمان‌بر هستند بسیار حساس و اختصاصی می‌باشند. قابل‌اطمینان بودن IFA به‌وضوح و روشنی نشان‌داده شده‌است و استانـدارد طلایی «تست‌ایده‌آل»  شناخته می‌شود IFA در بررسی‌های اپیدمیولوژی برای غربالگری خون‌دهنده‌های بانک خون و ابتلای جدید درافراد غیرایمن کاربرد دارد که از‌این‌طریق از ابتلا به مالاریا با خون‌ آلوده‌ی اهداکنندگان جلوگیری به‌عمل می‌آید، به‌عنوان مثال درفرانسه به‌عنوان قسمتی از یک استراتژی هدفمند غربالگری اهدا‌کنندگان خون را انجام می‌دهند، اساس IFA این است که آنتی‌بادی گونه فالسی‌پاروم را در دوهفته‌ی اول عفونت با آنتی‌‌ژن تثبیت‌شده روی لام شناسایی کنیم و 3 الی 6 ماه پس‌از استقرار انگل تست را مکرراً تکرار و تأیید می‌کنیم، آنتی‌ژن ثابت‌شده روی لام را تا زمان مصرف در منهای‌30‌درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌کنیم. بااین روش LgG و IgM هر‌دو را می‌شود بررسی کرد معمولاً تیتر 1/20 مثبت و کمتر از آن منفی تلقی می‌شود. تیتر بیش‌از 1/200 نشانه‌ی جدید‌بودن بیماری است به‌طور خلاصه IFA ساده و حساس است (اما عیب آن این است که وقت‌گیر است و نمی‌توان آن را اتوماتیک کرد و تعداد نمونه‌هایی را که می‌شود با آن انجام داد محدود است و ممکن‌است روزانه‌ آزمایش انجام شود. عیب دیگر آن نیاز به میکروسکپ فلوئورسانس است به‌علاوه تکنسین ورزیده‌ی با تجربه و آموزش دیده می‌خواهد و نتیجه مستقیماً بستگی به مهارت تکنسین دارد به‌خصوص در‌مورد نمونه‌های حاوی آنتی‌بادی ضعیف و کم‌. عیب بعدی آن این است که فقدان آنتی‌ژن IFA استاندارد شده آن را برای کارهای روزمره درمراکز انتقال‌خون غیر‌قابل استفاده می‌نماید و برای هماهنگ‌کردن نتایج داخلی آزمایشگاه مناسب نخواهد بود.
 روشهای تشخیص ملکولی:
 همانطور که اشاره شد روش‌های سنتی تشخیص مالاریا همچنان مشکل‌دار می‌مانند روشهای آزمایشگاهی جدید که حساسیت و اختصاصی بودن بالایی دارند بدون تغییرات در آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند به‌نظر می‌رسد گسترش روشهای مولکولی بیولوژیکی مانند MS-LAMP-PCR فلوسیتومتری FCM  اجازه می‌دهد شناسایی دقیق انگل و بیماری انجام شود به همین جهت استفاده از‌این روش‌ها معمول شده‌است.
 PCR:
این روش یک روش تشخیص مولکولی است که اخیراً برای تشخیص مالاریا به‌کارگرفته شده است و می‌رود که یکی‌از حساس‌ترین و اختصاصی‌ترین آزمایش‌های مالاریا شود، به‌خصوص برای مواردی‌که  تعداد انگل خیلی کم باشد یا آلودگی مخلوط باشد. PCR برای تأیید روش‌های دیگر نیز به‌کارگرفته می‌شود و همینطور در‌مورد کنترل درمان و مقاومت دارویی مفید است معلوم شده که بسیار از QBC حساستر است همینطور برخی از روش‌های RDT حساستر می‌باشند و ممکن‌است روش ممتاز محسوب شود، حساستر واختصاصی‌تر از آزمایش میکروسکپ با لام رنگ شده خون محیطی می‌باشد، PCR به تشخیص 1تا5 انگل در میکرولیتر خون جواب می‌دهد که مساوی یا کمتر از 0/0001 گلبولهای قرمز آلوده است، درصورتی‌که روش میکروسکپ و RDT ، 50تا100 انگل در میکرولیتر است به‌علاوه همانطور که گفته شد PCR ممکن‌است مقاومت دارویی انگل را نیز نشان دهد و ممکن‌است اتوماتیک شود و تعداد زیادی نمونه را جوابگو باشد برخی روشهای اصلاح شده PCR می‌رود که بسیار اطمینان بخش باشند به‌عنوان مثالReal time PCR-Nested PCR نسخه‌برداری معکوس بسیار مفید هستند و در‌مواردی‌که روش‌های سنتی نتیجه‌ی شفاف ندارند و بیماران علائم مالاریا را دارند شک را رفع خواهند کرد، PCR قادر است گونه‌ها را دقیقاً تشخیص دهد اخیراً قدرت شناخت خود درمورد گونه Knowlesi را نشان داده است، روی هم رفته PCR می‌رود که دو مشکل بزرگ تشخیص مالاریا یعنی حساسیت و اختصاصی‌بودن را حل‌کند، تنها محدودیت‌های PCR پیچیدگی‌ روش‌ها، هزینه‌ی بالا و نیاز به تکنولوژیست دوره دیده‌‌ی ماهر می‌باشد.
استفاده از PCR درکشورهای درحال رشد و توسعه که امکانات کافی ندارند مشکل است برای PCR  کنترل کیفی ومراقبت ازدستگاهها بسیار ضروری است به‌همین دلایل PCR در شهرک‌ها، روستاها و درمانگاهها جایی ندارد.
LAMP:
ادعا می‌شود که این روش یک روش ملکولی ساده‌ی کم‌هزینه برای تشخیص مالاریاست که ممکن‌است 185‌ریبوزوم ژن RNA پلاسمودیوم فالسی‌پاروم را شناسایی کند. نتایج بررسی‌های بیشتر نشان داده‌است که حساسیت و اختصاصی‌بودن LAMP منحصر به گونه‌ی فالسی‌پاروم نیست بلکه برای ویواکس ـ‌ اواله ـ مالاریا نیز حساس است. در‌این بررسی پیشنهاد شده‌است که LAMP بیشتر مورد اعتماد است و برای غربالگری مالاریا و بیماری‌هایی که  ناقل دارند ممکن‌است مفید باشد. LAMP نسبت به PCR ساده، حساس،، سریع و کم‌هزینه است. با این همه مشکلات آن این است که معرف‌ها باید سردنگهداری شوند و برای تأیید کامل آن باید به هماهنگی ‌جواب‌ها با کلینیک بیمار تـوجـه کـرد.
Microarray:
ژنوم پلاسمودیوم راهگشای فرصت برای تشخیص مالاریاست «میکرواری» ممکن‌است در‌آینده برای تشخیص بیماری‌های عفونی نقش مهمی داشته باشد. این روش هنوز  درمراحل ابتدایی است وتعمیم نیافته است، در«میکرواری» پیوند هدفهای شناخته شده منشعب ازاسیدهای نوکلئیک در نمونه‌ی آزمایش به‌پروب‌هایی که قادرند ژن چند‌تایی را تحت‌تأثیر قراردهند اثر می‌کنند.  روش را می‌توان اتوماتیک کرد و تعداد بیشتری نمونه را بررسی کرد، گروه کم نوکلئوئید میکرب‌ها را با این روش می‌شود شناسایی کرد، با این روش برای شناسایی پلاسمودیوم فالسی‌پاروم کار شده و نتیجه‌ رضایت‌بخش بوده‌است.
روش FCM:
 استفاده از فلوسیتومتری درتشخیص مالاریا گزارش‌ شده‌است. اساس این روش اندازه‌گیری هموزوئین است، وقتی‌که انگل داخل گلبول قرمز است هموگلوبین آن را هضم می‌کند و حلقه هم Hem را آزاد می‌کند که تبدیل به هموزوئین می‌شود که هموزوئین داخل واکوئل‌های غذایی سلول، کریستال می‌شود، هموزوئین ضمن فاگوسیتور ممکن‌است اندازه‌گیری شود که با غیر قطبی کردن نور لیزر در خلال عبور سلولها از یک کانال دستگاه فلوسیتومتر  اندازه‌گیری می‌شود حساسیت این روش 49  تا 98 درصد واختصاصی بودن آن 82تا97 درصد برای مالاریاست. معایب آن گرانی دستگاه، پرهزینه بودن روش و نیاز به تکنسین بسیار ورزیده و داشتن مثبت کاذب دراثر وجود عفونت‌های ویروسی و میکربی است با این همه برای غربالگری مالاریا خوبست.
سل‌کانتر خودکار خون ACC:
سل‌کانتر برای تشخیص مالاریا روش خوبی است، دراین مورد سه‌بررسی انجام شده‌است:
درمــورد اول از ســل‌کانـــتر cell-Dyn 3500 استفاده شده و رنگدانه‌ هموزوئین دیده شده‌است که داخل منوسیت‌ها بوده و حساسیت 95٪ نشان داده‌است و اختصاصی‌بودن 88٪ بوده‌است که با روش سنتی میکروسکپ نوری هم‌آهنگ بوده‌است.
مــــورد دوم ماننــد اول از ‌cell-Dyn 3500  استفاده شده‌است با نور لیزر غیر‌قطبی‌(DLL) و مالاریا تشخیص داده‌شد با حساسیت 73‌درصد و اختصاصی‌بودن 96‌درصد بود.
در مورد سوم با کولتریکمن کار شد مقدار منوسیت‌های فعال شده با حجـم، قدرت هــدایت و پــراکنــدن (vcs) باعــث تشخیص مالاریا با حساسیت 98درصد و اختصاصی‌بودن 94درصد شده است.
هیچیک از این سه روش در آزمایشگاه‌های درمانگاهی در دسترس نیستند، برای تعیین ارزش این روش نیاز  به بررسی‌های بیشتر و بررسی نرم افزار دستگاه احساس می‌شود.
سپکتروفوتومتری گروهی:
این روش جدید با حساسیت 10 انگل در میکرولیتر خون اخیراً معرفی شده است که خون تام را با سپکتروفوتومتر، اشعه‌ی UV لیزری تشخیص می‌دهد و به (LDMS) مشهور است. دراین روش مبنا همان نشانگر حیاتی هموزوئین و تجسس آن می‌باشد. این روش درآینده بهتر خواهد شد، اخیراً روش‌های قابل‌اعتماد دیگری هم مطرح شده‌اند که برخی از آنها در دسترس هستند مثل الایزاـ ELISA ـ  لاتکس، آگلوتیناسیون و کشت و دیدن انگل زنده‌ی مالاریا و بالاخره پس‌از مرگ بیماران مالاریـایی انگـل را با اتــوپـسی درکبد، طحال، کلیه و مغز آنان می‌شود دید.
 خلاصه ونتیجه‌:
با همه‌ی روش‌های جدیدی که ذکر شد هنوز هم روش سنتی قطره‌ی ضخیم و گسترش معمولی و رنگ‌آمیزی و دیدن با میکروسکپ‌نوری عالیترین روش است فقط نیاز به تکنسین بسیار متبحر و آموزش‌دیده دارد و دقت و صحت و حساسیت آن با روش‌های جدید متفاوت است و بسیار قابل‌اطمینان و کم‌هزینه است.
RDTs سریع است و دربسیاری نواحی دوردست پیاده شده‌است ولی پرهزینه است و نیاز به کنترل کیفی دارد، روش‌های سرولوژیکی برای بررسی‌های اپیدیولوژیکی مفید هستند ولی برای مالاریای حاد مناسب نیستند. روش‌های بیولوژیکی ملکولی برای آزمایشگاه‌های تحقیقاتی مناسبند همینطور برای بررسی مقاومت دارویی خوب هستند. به‌علاوه برای تشخیص گونه‌ها و درمواردی‌که تعداد انگل کم است بسیار مناسب هستند. بالاخره سطح بومی بدون مالاریا،  فوریت تشخیص،  تجربه‌ی پزشک، کفایت گروه پزشکی و منابع بودجه‌یی عواملی هستند که در انتخاب روش مؤثرند.