محققان با برآوردهای به‌دست‌آمده نشان دادند که مایکوپلاسماها (باکتری‌هایی که دیواره سلولی ندارند) می‌توانند بین ۱۰تا ۸۵ درصد از خطوط سلولی را در یک آزمایشگاه میکروب شناسی تحت الشعاع قراردهند و توضیح‌می‌دهند که بهترین راه برای مراقبت از خود در‌برابر این باکتری چیست. این باکتری‌ها همه‌جا حضور‌دارند، تشخیص آنها سخت است و به‌طور بالقوه می‌توانند به تحقیقات محققان آسیب برسانند. مایکوپلاسماها در حقیقت دشمنان نامرئی هستند که نباید به آنها بی‌توجهی‌کرد. حتماً بسیاری از دانشمندانی که در بخش کشت یاخته کار‌‌می‌کنند، برایشان اتفاق افتاده است که سلول‌های کشت‌شده خود را بیرون از انکوباتور بگذارند و برای اولین‌بار نشانه‌های این آلودگی را با چشم خود ببینند و متوجه آن شوند. در‌مورد باکتری‌ها، خواه این فرایند زرد‌شدن محیط‌کشت سلولی باشد یا توده‌های شناور حاکی‌از یک قالب «جُلینه» شده (به توده‌ای از رشتههای «میسل» یک قارچ، جلینه گفته‌می‌شود)، نشانه‌های هشدار اولیه می‌تواند اغلب به حد کافی توجیه کننده و واضح باشد. با این حال، داستان مایکوپلاسما کمی فرق‌می‌کند. برخلاف باکتری‌های دیگر، باکتری‌های مایکوپلاسما فاقد دیواره سلولی هستند. به‌این‌معنا که آنها در‌برابر تعدادی از آنتی‌بیوتیک‌های رایج مقاوم هستند که در کشت‌های یاختهای به‌صورت منظم استفاده‌می‌شوند. علاوه‌بر‌این، آنها به‌طور بی‌رحمانه‌ای نیز غیرقابل‌شناسایی هستند. برخلاف دیگر انواع باکتری‌ها که زیر میکروسکوپ به ذرات جنبنده سیاه‌رنگ می‌مانند، مایکوپلاسماها فقط زیر میکروسکوپ‌های الکترونی قابل‌رؤیت هستند. این به‌آن‌معنا می‌باشد که عفونت چنین باکتری‌هایی می‌توانند ماه‌ها پیش بروند بدون اینکه نشانه‌های اولیه‌ای بروز داده شوند. حال چرا تا‌این‌حد از اهمیت مایکوپلاسماها گفتیم؟ متأسفانه عفونت مایکوپلاسما نشان‌داده است که می‌تواند به بسیاری‌از پروسه‌های سلول میزبان آسیب برساند و آنها را تحت‌تأثیر خود قرار‌دهد. تحقیقات حاکی از‌این می‌باشد که چنین عفونتی می‌تواند منجر به ناهنجاری‌های کروموزومی، مهار رشد سلولی، بازدارندگی متابولیسم و اختلال در ترکیب اسیدنوکلئیک شده و حتی قادر‌است مرگ سلول را موجب‌گردد. به‌همین‌دلیل این عفونت می‌تواند با استفاده از خطوط سلولی آلوده شده، به‌طور‌جدی کیفیت تحقیق را تحت‌الشعاع قرار‌دهد! به‌طوری‌که حتی نمی‌توان پدیده‌های مشاهده‌شده دیگر را از فعالیت مایکوپلاسماها مستقل دانست.
چند آزمایش ساده وجود دارد که می‌توان انجام‌داد، مانند آزمایش تک‌تک نمونه‌هایی که بار اول است به داخل آزمایشگاه آورده‌می‌شوند و همچنین نظارت روتین روی سطح آلودگی بین خطوط سلولی. این تشخیص می‌تواند به بهترین روش ازطریق شناسایی فعالیت آنزیمی (مخصوص مایکوپلاسما) انجام شود. این روش وقوع مثبت‌های کاذب را از‌بین‌می‌برد. علاوه‌بر‌این‌ها، با استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های مؤثر می‌توان جلوی آلودگی اولیه را گرفت و همچنین کمک‌کرد تا تجمع نمونه‌ها و کیفیت خروجی تحقیق حفظ گردد.
این دشمن اغلب در کمین و همه‌جا حاضر‌است اما دیده‌نمی‌شود. بسیاری‌از دانشمندان آشنا به کشت یاخته، به‌خوبی از نشانه‌های شایع این آلودگی خبردارند. باکتری‌ها بیشتر اوقات برای استخراج رنگی زرد به‌همراه یک محلول نسبتاً کدر، به«pH» محیط‌کشت حمله‌می‌کنند. از‌طرفی‌دیگر، مخمر تغییری در محیط‌کشت ایجاد‌نمی‌کند اما اغلب وقتی آلودگی بیشتر‌می‌شود و عود‌می‌کند، باعث تیرگی آن میگردد. آلودگی‌های قارچی نیز اغلب خیلی راحت دیده‌می‌شوند، قارچ به‌طور‌معمول روی سطح‌کشت شناور است و بسیاری‌از اوقات به رشتههای میله‌ای مرتبط با سلول‌های کشت‌شده می‌مانند. تمامی این آلودگی‌ها یک ویژگی مشترک دارند و آن این است که همگی زیر میکروسکوپ قابل‌رؤیت هستند (دست‌کم وقتی زیر‌نظر یک فرد ماهر و خبره در امر کشت یاخته قرار‌گیرند) اما این ویژگی، باکتری مایکوپلاسما را شامل‌نمی‌شود.
این باکتری‌ها همه‌جا حضور‌دارند، تشخیص آنها سخت‌است و به‌طور بالقوه می‌توانند به تحقیقات محققان آسیب‌برسانند. مایکوپلاسماها در حقیقت دشمنانی نامرئی هستند که نباید به آنها بی‌توجهی کرد.
کلمه «مایکوپلاسما» بسیار وسیع است و می‌تواند توصیف‌کننده طیف گسترده‌ای از باکتری‌های کوچک و بدون دیواره از طبقه مالیکوت‌ها (Mallicute Class) باشد که شدیداً در محیط پخش هستند (آنها می‌توانند انسان و دیگر پستانداران، خزندگان، حشرات و حتی گیاهان را مورد هدف خود قراردهند). این ویژگی که همه‌جا پخش هستند و حضور دارند، مشکلی اساسی برای افراد فعال در بخش کشت یاخته به‌حساب‌می‌آید و برای نمونه می‌توان به دشواری آوردن آنها به آزمایشگاه اشاره‌کرد. علاوه‌بر‌این، بسیاری‌از آنتی‌بیوتیک‌هایی که به‌طور رایج در کشت ساخته مورد‌استفاده قرار‌می‌گیرند مانند پنی‌سیلین، مبنای عمل خود را روی هدف آنهایی که دیواره سلولی دارند پایه‌گذاری‌می‌کنند؛ ویژگی که یک باکتری مایکوپلاسما ندارد. آلودگی مایکوپلاسما هیچ نشانه قابل‌رؤیتی از خود نشان‌نمی‌دهد و حتی تجمع بیش‌از‌حد نیز تغییری درPH محیط‌کشت ایجاد نخواهد‌کرد و به کدورت رنگ آن نیز منجر نخواهد شد. برخلاف باکتری‌های دارای دیواره‌سلولی، مایکوپلاسماها (که تنها بین ۰/۲تا ۰/۳ میکرومتر [µm] هستند) تنها می‌توانند زیر میکروسکوپ‌های الکترونی دیده‌شوند؛ به‌این‌معنا که آنها نمی‌توانند ازطریق روش‌های استاندارد فیلتراسیون از محیط‌کشت سلولی برداشته شوند. به‌دلیل ویژگی همه‌جا حاضربودن آنها هم در محیط طبیعی و هم در بدن انسان و توانایی آنها در جاخالی دادن از روش‌های تشخیصی و پیشگیرانه، آلودگی مایکوپلاسماها می‌تواند تا ماه‌ها غیرقابل تشخیص باقی‌بماند. اگر این نوع باکتری‌های به‌ظاهر بی‌ضرر نه می‌توانند دیده شوند و نه شنیده شوند، چرا باید برای افرادی‌که در آزمایشگاه‌های کشت یاخته کار می‌کنند تا این اندازه اهمیت داشته باشند؟ همانطور که پیش‌تر اشاره‌شد، آلودگی مایکوپلاسما می‌تواند روی بسیاری‌از سلول‌های میزبان مهم تأثیر بگذارد. حتی نشان‌داده شده‌است که آنها منجر به مرگ سلول نیز شده‌اند و پاشیدگی DNA ناشی‌از حضور نوکلئازهای مایکوپلاسمایی می‌تواند «خزان یاختهای» را تقلید‌کند (تقلید مرگ سلولی) که این خود موجب برهم ریختگی و اختلال در داده‌های به‌دست‌آمده می‌شود. از‌این‌رو حضور مایکوپلاسماها در کشت‌های سلولی می‌تواند به طرزی جدی کیفیت تحقیق را تغییر‌دهد. نشانه‌های اولیه داخل خود سلول‌های آلوده‌شده (البته اگر خود‌را بروز بدهند) ممکن‌است درونی باشد. نشانه‌هایی مانند کاهش در ویژگی‌های پرولیفراتیو (تکثیری)، نتیجه رشد گسترده مایکولاسما و رقابت تبعی برای ماده‌های غذایی با سلول‌های میزبان. به‌طور مشابهی، به‌دلیل تأثیری که مایکوپلاسماها روی پویایی ماده ژنتیکی سلول میزبان می‌گذارند، بازدهی انتقال می‌تواند به طور چشمگیری در کشت‌های آلوده پایین بیاید. توانایی مایکوپلاسما در جلوگیری‌از شناسایی‌شدن می‌تواند به اتلاف وقت در عیب‌یابی و اغلب تغییرات مبهم در فنوتیپ و یا فعالیت سلول‌های داخل کشت منجر شود. بنابراین، تشخیص این باکتری نیازمند تکنیک‌های پیچیده‌ای می‌باشد که بتوان به‌واسطه آنها تجمع و یکپارچگی نمونه‌ها و همچنین کیفیت تحقیق را حفظ‌کرد.
گرچه مقابله با آلودگی باکتری مایکوپلاسما خیلی دشوار و طاقت‌فرسا به‌نظر‌می‌رسد اما روش‌هایی وجود دارند که بشود توسط آنها به‌گونه‌ای این باکتری را به درستی شناسایی‌کرد.
حال پرسش اینجاست که این باکتری چگونه به داخل آزمایشگاه کشت سلول راه پیدا‌می‌کند؟ اولین دلیل، آلودگی دیگر خطوط سلولی است (بر‌اساس برآوردها به‌طور‌حتم، ۱۵تا۳۵درصداز خطوط ادامه‌دار محیط‌کشت سلولی آلوده می‌شوند) اما باکتری‌های مایکوپلاسما را همچنین می‌توان در بزاق، پوست و موهای بدن نیز یافت‌کرد؛ به‌این‌معنا که پرسنل آزمایشگاه می‌توانند خود ناقل این آلودگی باشند. علاوه‌بر‌این، «واکنش گر‌ناب» کشت مانند «سرم جنین گاو» و آنزیم تریپسین به‌دست‌آمده از خوک می‌تواند به آلودگی مایکوپلاسما منجر‌شود که به‌طور‌طبیعی اندام‌هایی که این باکتری به‌واسطه آنها ترکیب شده‌است، مورد هدف قرار‌می‌گیرند.
ابتدا به ساکن در اولین مرحله از متد شناسایی این باکتری، تمامی خطوط سلولی و نمونه‌ها و واکنش گرناب‌های منابع جدید، باید مورد آزمایش و بررسی قرار‌گیرند. همچنین هر۱یا۲هفته نیز باید روی نمونه‌ها در داخل آزمایشگاه آزمایش روتین انجام شود. بهترین استاندارد برای آزمایش مایکوپلاسما، تست آگار کشت است که به‌وسیله آن، نمونه‌ای کوچک از محیط‌کشت به لابراتوار برای ارزیابی فرستاده‌می‌شود. این نمونه روی ظرف آگار گذاشته‌می‌شود و حضور مایکوپلاسما ازطریق شناسایی تعداد باکتری و قارچ‌های زنده در‌آن محیط، مشخص‌می‌شود. این فرایند بسیار زمان‌بر است که اغلب تا ۴هفته به‌طول می‌انجامد. روش‌های مبتنی‌بر PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) نیز می‌توانند برای شناسایی این از نوع آلودگی به‌کار‌گرفته شوند اما درجه تأثیر آنها به حضور مواداولیه مناسب برای توالی باکتری‌های مایکوپلاسما بستگی دارد (کافی است که یکی‌از آنها جا‌بیافتد تا مایکوپلاسما از دام شناسایی بگریزد). علاوه‌بر‌این، برخی از روش‌شناسی‌هایی که PCR را به‌کار‌می‌گیرند، می‌توانند به مثبت‌های کاذب منتج شوند، چراکهDNA یک باکتری مایکوپلاسمای مرده نیز می‌تواند شناسایی شود (این روند نیز شاید تا‌حدی زمان‌گیر باشد و شاید 2تا4ساعت به درازا بکشد).
فن‌آوری‌های جدید از سیگنال‌های زیست‌تابی تولید‌شده توسط آدنوزین تری‌‌فسفات تحریک‌شده توسط روش لوسیفراز استفاده‌می‌کنند که نشان‌دهنده مایکوپلاسما به‌همراه اضافه‌شدن بسترهای مناسب برای آنزیم‌های مخصوص مایکوپلاسما می‌باشد (مانند کیت مایکوآلرت شناسایی مایکوپلاسما، ساخت شرکت لونزا). چنین فن‌آوری‌هایی از فعالیت آنزیم‌های مایکوپلاسمای یافت‌شده در گونه‌های رایج مایکوپلاسما و اغلب ۱۸۰گونه شناسایی‌شده مایکوپلاسما بهره‌برداری‌می‌‌نمایند که کشت سلولی را آلوده‌می‌کنند. این تکنیک می‌تواند به آسانی در آزمایشگاه انجام‌شود و قوانین آن نیز بسیار واضح و ساده است و به هیچ خارج‌سازیDNA نیز احتیاج ندارد. مایکوپلاسما در نمونه آزمایش (به‌طور‌نرمال محیط‌کشت سلولی تازه) مورد تحلیل و بررسی قرار‌می‌گیرد و واکنش برخیاز آنزیم‌های خاص که تنها در مایکوپلاسما (با بستر کیت) یافت‌می‌شوند، باعث تغییرADP (آدنوزین دی‌فسفات) به ATP (آدنوزین‌تری‌‌فسفات) میگردد و سیگنال زیست‌تابی تولید‌می‌کند. برای آن‌که یک ضریب درست شناسایی‌شود و نشان‌دهد که دقیقاً چه مقدار از باکتری‌های مایکوپلاسما وجود‌دارند، باید قبل و بعد‌از اضافه‌کردن بستر، آزمایشاتی انجام‌شود. اگر این میزان آستانه برآورده گردید و یا از‌آن‌حد بیرون‌زد، یعنی نمونه مثبت است. برخلاف تست، کشت اگر ۴هفته طول‌می‌کشد، سنجش به روش لوسیفراز تنها ۲۰دقیقه به‌طول‌می‌انجامد. عملیات تبدیلADP به ATP در‌حضور بستر اضافه‌شده، به‌این‌معناست که تنها مایکوپلاسماهای زنده مورد آزمایش قرار‌گرفته‌اند و تمامی مثبت‌های کاذب که می‌توانند با استفاده از روشPCR برای شناسایی به‌دست‌آیند، از‌بین‌می‌روند. بهینه‌سازی روش‌های نوین این چنینی است که می‌تواند تست مایکوپلاسما را در روش هفتگی کشت‌یاخته بگنجاند و متعاقباً همین امر باعث خواهد‌شد تا تجمع و یکپارچگی نمونه‌ها و کیفیت آنها ارتقا یابد و سطح قابلیت نشر این نوع تحقیقات نیز به‌طور قابل‌توجهی بالا‌رود.
شناسایی آلودگی مایکوپلاسما در‌مقایسه با دیگر باکتری‌ها و یا عفونت‌های‌قارچی بسیار کار سخت‌تری است.
در بسیاری‌از موارد، در‌پی تشخیص مثبت آلودگی، کشت یاخته تنها دور انداخته می‌شود و یکی دیگر مورد استفاده قرار‌می‌گیرد اما این کار همیشه نمی‌تواند گزینه خوبی باشد، مخصوصاً برای نمونه سلول‌های باارزش که منبع‌گیری آنها بسیار دشوار است و به زمان زیادی برای رشد نیاز دارند. آنتی‌بیوتیک‌های بسیاری وجود دارند که می‌توانند در‌برابر گونه‌های مایکوپلاسما به‌طور مؤثری عمل‌کنند مانند نئومایسین، تتراسایکلین و جنتامایسین. با این وجود، اینها نیز محدود به برخیاز گونه‌های مایکوپلاسما می‌شوند که نمی‌توانند درمانشان کنند و تنها می‌توانند رشد آنها را متوقف سازند (به‌این‌معنا که اگر درمان با آنتی‌بیوتیک قطع‌شود تجمع مایکوپلاسماها بیشتر‌می‌شود). همچنین بررسی‌ها نیز نشان‌می‌دهند که حجم بالایی از مقاومت باکتری‌ها در‌برابر آنتی‌بیوتیک‌ها (۸۰درصد در‌مورد جنتامایسین) به‌این‌معنا است که استفاده صرف از آنها برای از‌بین‌بردن کامل این باکتری‌ها، کافی نیست. برخی واکنش‌‌گر‌ناب‌های مؤثر نیز به‌صورت تجاری موجود هستند که می‌توانند در ترکیب درمان بیوفیزیکی با آنتی‌بیوتیک‌ها برای ردیابی عفونت، کارآمد عمل‌کنند. راه‌حل‌های این چنینی به لحاظ میزان مسمومیت اغلب تأثیر کمی روی سلول‌های پستانداران دارند و جهانی هستند (طیف وسیعی‌از گونه‌های مولیکوتی را از کشت یاخته برداشته‌اند). زمانی‌که این روش تکمیل شد، آزمایش می‌تواند ریشه‌کن‌شدن گونه‌های باکتری مایکوپلاسما را از کشت تأیید‌کند. جا‌دارد اهمیت شامل‌کردن آنتی‌بیوتیک‌های مؤثر در کشت‌های سلولی به‌طور روتین را نیز در‌نظر بگیریم، چراکه این‌گونه بروز عفونت و آلودگی کاهش پیدا‌می‌کند. چنانچه مضرات مایکوپلاسماها درون آزمایشگاه خود را نادیده بگیرید، ممکن‌است به‌شدت از کیفیت نمونه‌ها و تحقیق شما کم شود؛ چراکه گفته‌می‌شود فعالیت مایکوپلاسما می‌تواند به هر‌جنبه از متابولیسم سلولی آسیب برساند. حضور این باکتری‌ها حتی می‌تواند خیلی از مشاهده‌ها را بی‌ارزش کند. اکنون یافتن روش‌های شناسایی صحیح آنها و همچنین راه‌های ریشه‌کن کردن و یا پیشگیری‌از بروز عفونت ناشی‌از مایکوپلاسماها آسان‌تر شده‌است، به‌این‌معنا که می‌توان با جای‌دادن چنین تکنیک‌هایی درون برنامه‌های روتین آزمایشگاهی و کمی وقت گذاشتن روی آنها، این مشکل را حل‌کرد. لابراتوارهای دانشگاهی نیز باید به‌این موضوع توجه خاصی داشته باشند زیرا در چنین مکان‌هایی اغلب پرسنل تازه‌کار هستند و ممکن‌است ناخواسته دعوت این باکتری‌های مضر را با آغوش باز بپذیرند. مایکوپلاسما می‌تواند یک دغدغه اساسی برای افراد شاغل در بخش کشت سلول باشد اما علم به آنها ابزار‌ها و فن‌آوری‌هایی ارزانی داشته است تا بتوانند به‌واسطه آنها این دردسرسازان کوچک را یک‌باره و برای همیشه به تله بیاندازند.
ثبت نظر