بیماریهای قابل انتقال بین انسان و حیوان (زئونوزها) (۱۰)

نتایج:

مشخصات میکروبیولوژی و بیوشیمیایی ـ سلول‌های BO1درمحیط‌هایSBAیاRBAبا یا بدون 5٪ گاز CO2 در 35 تا37 درجه سانتی‌گراد برای مدت 24 تا 48ساعت به‌صورت میله‌های کوچک کوکوئیدگرم منفی رشد می‌کنند. پرگنه‌های مجزاکروی شکل،محدب، کامل،صاف(اسموس)، ماتو به‌قطر1تا2 میلیمتر پس‌از 48 ساعت کشت می‌باشند.BO1 برای‌رشد‌درمک‌کانگی‌آگار، اکسیداز، کاتالاز، احیای نیترات باتولید‌گاز، رشد در نوترینت براس با یا بدون 6٪ کلروسدیم، واکنش سریع اوره‌آز (کمتر از5 دقیقه)  و رشد در 25 ،37 و42 درجه سانتی‌گراد مثبت است.

تمامی آزمایش‌های بیوشیمیایی درشرایط هوازی انجام پذیرفته است. همولیز پس‌از 24‌ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتی‌گراد مشاهده نمی‌شود. سویهBO1 غیرمتحرک بوده و ازنظر هیدرولیز اسکولین، آب کردن ژلاتین، تولید اندول، استفاده از سیترات، رشد درسنتریمید و SS آگار منفی است. تولید اسید برپایه‌ی اکسیداسیون ‌ـ ‌ فرمانتــاسیــون کینــگ (Kings O-F base) از D‌- گلوکز و D-گزیلوز مشاهده شده، درحالی‌که از مانیتول ، لاکتوز، سوکروز و مالتوز هیچگونه تولید اسیدی مشاهده نمی‌گردد. رشد سویه BO1 درخصور رنگ‌های تیونین‌(رقت‌های ۱/۲۵۰۰۰، ۱/۵۰۰۰۰، ۱/۱۰۰۰۰۰) و فوشین بازیک (رقت‌های۱/۵۰۰۰۰و ۱/۱۰۰۰۰۰) جلوگیری نشده ودرسرم فیزیولوژی فنل‌دار ژل تشکیل نمی‌دهد. سویهBO1 آگلوتیناسین ضعیف یاهیچ‌گونه آگلوتیناسیونی به‌ترتیب با آنتی‌سرم‌های مونواسپفیکA‌وM نشان داده، و به لیز با فاژ تی‌بی‌لیزی (Tb) در دو رقت روتین تست و چهار برابر آن (4XRTD و1X) حساس نمی‌باشد.

الگوی حساسیت به داروهای ضد میکربی سویه BO1 تعیین شده و با سویه‌های رفرانس بروسلا مورد مقایسه قرارگرفته است. با استفاده از معیارتفسیری CLSI برای گونه‌های بروسلا، سویه BO1 به مواد ضد‌میکربی زیر شامل: داکسی‌سیکلین (۰/۱۲ میکروگرم/میلی‌لیتر)، تتراسیکلین (۰/۲۵‌میکروگرم/میلی‌لیتر)، استرپتومایسین (۲میکروگرم/میلی‌گرم) جنتامایسین (۱میکروگرم/ میلی‌لیتر و تری متوپریم سولفامتوکسازول (کمتراز ۰/۵ و ۹/۵ میکروگرم/میلی‌لیتر) حساس می‌باشد. الگوی حساسیت ضدمیکربی سویهBO1 به الگوی دیگر سویه‌های گونه‌های بروسلا (2ba) مشابه بوده‌است.

آنالیز اسیدهای چرب سلولی (CFA) انجام شده والگوی سویه BO1 باسویه‌های رفرانس بروسلا مورد مقایسه قرارگرفته است. الگوی CFA سلول کامل سویه BO1 با الگوی بروسلا آبورتوس، بروسلا ملی تنسیس، بروسلا ملی تنسیس، بروسلا نئوتومه، بروسلا اوویس و بروسلا سوئیس مشابه بوده و با مقادیر اصلی (۵تا۴۶‌درصد) C19:0cyc11-12, C18:1w7C،C18:0 وC16:0 و مقادیـــر کمتــر (۱‌تا‌۴‌درصـد) Br-C19:1 مشخص می‌‌گردند.

مشخصات مولکولی:

ویژگی‌های استاندارد میکروبیولوژی، ازجمله الگوهای حساسیت به داروهای ضد‌میکربی واسیدهای چرب سلولی (CFA)، بر جانشینی سویه BO1 به‌عنوان عضوی از گونه بروسلا دلالت داشته،اما شناسایی معتبرگونه تعیین نگردید. ازاین رو، بررسی‌های مولکولی ترادف ژن 16s‌rRNA  جهت تأیید به‌عنوان گونه‌یی از بروسلا صورت پذیرفته است. ژن 16s‌rRNA از DNA ژنومی BO1 درمقایسه با گونه‌های شناخته شده بروسلا و تیپ سویه آکروباکتروم اینترمدیوم مورد بررسی قرارگرفته است. درآنالیز نهایی 5 اختلاف پایه‌یی درموقعیت‌های 167تا170 و 234 بین BO1 وگونه‌های بروسلا، با نتیجه‌۹۹/۶٪ همانندی نشان داده شد. مقایسه ژن 16s‌rRNA سویه BO1 و آکروباکتروم اینترمدیوم14 اختلاف پایه‌یی، با همانند 99٪ را به‌دست داده است. نهایتاً، براساس یافته‌های ژن‌16s‌rRNA سویه‌BO1، روابط بین این سویه و دیگر بروسلاها (تیپ سویه بروسلا اوویس به‌عنوان نماینده گروه) و گونه‌های آکروباکتروم به‌ثبوت رسید. همچنین بررسی‌های هیبریدDNA-DNA سطح وابستگی ژنومی BO1 با دو سویه رفرانس 16M بروسلا ملی‌تنسیس و 1330 بروسلا سوئیس تأیید گردیده است. DNA ژنومی سویه BO1 با 32p نشان‌دار شده و نسبت‌های نسبی اتصال در هر‌دو درجه‌60 و 75 درجه سانتی‌گراد تعیین گردید. وابستگیDNA در60 درجه سانتی‌گراد 78تا80٪ و در 75‌درجه‌‌ی سانتیگراد 81 تا83٪ بوده است. این ارزش‌های هیبریدیزاسیون نشان داد که سویه BO1 عضوی از جنس بروسلا می‌باشد.

تـــرادف ‌DNA مــکرر 842pb)IS711) درتمامی گونه‌های بروسلا وجود داشته و به‌عنوان شاخص منحصربه‌فرد جنس شناخته شده‌است. این شاخص در ژنوم BO1 موجود بوده و ازنظر اندازه تقریباً مشابه سویه‌های بروسلا ملی‌تنسیس 16M و بروسلا اوویس (ATCC 25840) بوده است.  علاوه‌بر آن، چندین آمپلیکون بزرگ (1000bp<) در هر‌دو سویه BO1 و بروسلا اوویس مشاهده شده است.

اخیراً الگوی 9 جایگاهی MLSA در بررسی 160 سویه مختلف بروسلا در تمامی گونه‌ها و بایووارها در 27 موقعیت متمایز شناخته شده‌است. رابطه‌یBO1 و گونه‌های کلاسیک بروسلا تعیین شده، BO1 دارای آلل‌های مشخص در تمامی 9‌جایگاه بوده واختلاف ۱/۶۷٪ با دامنه‌یی از 23٪ تا ۲/۸۴٪ نسبت به دیگر سویه‌ها داشته است. شجره تکاملی/فیلوژنتیک براساس این فاکتور بر وابستگی خارج گروهی آشکار سویه BO1 ازدیگر گونه‌ها اشاره دارد. با وجود این، در بررسی نهایی تعیین رابطه بین سویه‌های رفرانس بروسلا (بروسلا آبورتوس544، بروسلا ملی‌تنسیس 16M، بروسلا اوویس‌63/290 بروسلا نئوتومه 5K33، بروسلاکنیس‌RM6/66، بروسلا سوئیس1330 و بروسلا پستانداران دریایی36/94)، تیپ سویه‌های آکروباکتروم (آکروبــاکتروم گریــگنوننس LMG18954T، آکروباکتروم گالی نی‌فسیس DSM 1529ST، آکروباکتروم آنتروپیLMG 3331T، آکروباکتروم تری‌تی‌سی LMG18957T و آکروباکتروم اینترمدیوم LMG3301T)، و سویه BO1، هرچند که سویه BO1 از تمامی گونه‌های بروسلا متمایز بوده اما در تجزیه و تحلیل نهایی بیشتر به گونه‌های بروسلا تا اعضای گروه آکروباکتروم نزدیک می‌باشد.

بحث:

شناسایی سویه غیرمعمول بروسلا(BO1)جدا‌شده از زخم پیوندپستان خانم71‌ساله مورد بررسی قرارگرفته است. مورفولوژی پرگنه، رنگ‌آمیزی گرم و آزمایش‌های استاندارد میکروبیولوژی، سویهBO1 را کوکوباسیل غیرمتحرک، گرم منفی نشان داده است. نتایج حاصله از آزمایش‌های استاندارد مورد استفاده برای تایپینگ قطعی نبوده‌اند. این معیارها را فقدان واکنش‌با آنتی‌سرم‌های مونواسپسفیک برای آنتی‌ژن‌های Oـ لیپوپلی ساکاراید اکثر اعضای مشترک جنس بروسلا (به‌عنوان مثال، بروسلا آبورتوس، بروسلا ملی‌تنسیس، و بروسلاسوئیس)، تشکیل ژل (بروسلاکنیس)، ولیز به وسیله‌ی فاژتی‌بی لیزی Tb (بروسلا آبورتوس وبروسلاسوئیس) شامل بوده‌اند. با وجود این، سویه BO1 اوره را به‌سرعت هیدرولیز نموده (همانند بروسلاکنیس و بایووارهای 4،3،2،1و5 بروسلا سوئیس)، گاز H2S تولید کرده (مشابه بایووارهای 4،3،2،1و7‌ بروسلا آبورتوس و بایووار 1 بروسلا سوئیس) و درتمامی محیط‌های رنگی تیونین و فوشین (شبیه بایوواهای 2،1 و3 بروسلا ملی‌تنسیس و بایووارهای 3و4 بروسلا سوئیس) رشد کرده، که ازویژگی‌های برخی گونه‌هایی بروسلا می‌باشند. ازاین رو، نتایج روش‌های بایوتایپینگ سویه BO1 را با وابستگی بیشتر به بروسلا سوئیس تا دیگر اعضای جنس بروسلا پیشنهاد نموده است. الگوهای حساسیت به داروهای ضدمیکربی و اسیدهای چرب سلولی (CFA) این سویه مشابه دیگر گونه‌های بروسلا بوده است. وجود نسخه‌های متعدد IS711 نشان شاخص گونه‌های بروسلا بوده، و هیـــبریـــدیزاسیون DNA-DNA نیز کاملاً منطبق با دیگر اعضای جنس بروسلا بوده است.

نتایج بررسی DNA سویه BO1 طول کامل ژن 16s rRNA را با ۹۹/۶٪ همانندی دیگر گونه‌های بروسلا نشان داده است.سویه BO1 از 17 وابسته بروسلا، ازآکروباکتروم اینترمدیوم و آکروباکتروم آنتروپی متفاوت بوده و ازاین‌رو به‌عنوان سویه آتیپیک بروسلا پیشنهاد شده‌است. نتایج هیبریدیزاسیون DNA-DNA نیز به وضوح نشان داده که BO1 عضوی از جنس بروسلا می‌باشد.

در سطح نوکلئوتید، سویه BO1 تنها ۱/۶۷٪ با بروسلا آبورتوس ۵۴۴ اختلاف دارد. باوجود این، سویه BO1 درمقایسه با هردو گونه‌های بروسلا و آکروباکتروم بیشتر به بروسلا تا هر سویه دیگر از آکروباکتروم نزدیک می‌باشد.

مجموعه بررسی‌های میکروبیولوژی،  بیوشیمیایی و مولکولی سویه جدا‌شده از زخم پیوند پستان حاکی از آن است که سوی‌BO1 مشخصات عمومی جنس بروسلا را نشان داده اما از هر‌عضو پیش‌تر توصیف شده گونه‌های بروسلا متمایز می‌باشد. این مورد اولین نمونه‌ی بروسلوز انسانی ناشی‌از یک سویه غیرمعمول بروسلا با منشاء ناشناخته می‌باشد. جایگاه طبیعی بوم شناختی این سویه نامشکوف باقی‌مانده و به بررسی‌های بیشتری نیازدارد.