اندوتلیال عروقی ریوی، ترومبوز و آنژیوژنز در بیماری کووید-19

نارسایی‌پیشرفتۀ‌تنفسی(Progressive respiratory failure) ، به‌عنوان اصلی‌ترین عامل مرگ‌ومیر در همه‌گیری اخیر ناشی از کووید-19 نقش اساسی داشته است.پاتوفیزیولوژی این بیماری بصورت گسترده شناخته شده است، اما به لحاظ تغییرات مورفولوژی (ریخت‌شناسی) و مولکولی در ریه‌های محیطی بیمارانی که به دلیل ابتلا به این بیماری جان خود را از دست داده‌اند ، نسبتا ناشناخته مانده‌است.

عفونت ناشی از کروناویروس سندرم حاد تنفسی ۲ (SARS-CoV-2) با طیف گسترده‌ای از سندروم‎های تنفسی بالینی در ارتباط است و بروز نشانه‌های خفیف در مسیر هوایی فوقانی تا پنومی ویروسی پیشرفته و مهلک را شامل می‌گردد.به لحاظ بالینی تنفس بیماران مبتلا به کرونا ویروس حاد (کووید-19) دشوار است و این گروه دچار هایپوکسمی پیشرفته(progressive hypoxemia) می‎شوند و سرانجام این بیماران در اغلب اوقات نیز به استفاده از دستگاه ونتیلاتور می‌انجامد. با استفاده از سنجش برلین(Berlin criteria) جهت سندروم دیسترس تنفسی حاد (ARDS) ،رادیوگرافی‌نمای‌گراندگلاس(کدورت‌شیشۀ‌مات،ground-glass opacities) ریۀ‌محیطی روی سی‎تی‌اسکن انجام گرفت. کدورت شیشۀ مات ، یک یافتۀ غیراختصاصی در سی‌تی اسکن است که به شکل یک کدورت مه‌آلود خود را نشان می‌دهد و ساختارهای زیرین خود، برونش‌ها و عروق ریوی، را نامشخص نمی‌سازد.

براساس توصیف محققان در این پژوهش، به‌لحاظ بافت‏شناسی نشانۀبارز مرحلۀ نخستین سندرم دیسترس تنفسی حاد(ARDS)، شامل تخریب گستردۀ آلوِئولار همراه با ادم(diffuse alveolar damage with edema)، خونروی(hemorrhage) و رسوب و انباشت فیبرین درون آلوئولار(intraalveolar fibrin deposition) است. تخریب گستردۀ آلوئولار یافته‎ای غیراختصاصی است زیرا ممکن است علل عفونی یا غیرعفونی داشته باشد که عبارتند از: کرونا ویروس سندروم تنفسی خاورمیانه‎ای (MERS-CoV)، کرونا ویروس سندروم تنفسی حاد (SARS-Cov)، کرونا ویروس سندروم تنفسی حاد2 (SARS-CoV2) و ویروس‎ های آنفلوآنزا.

از جمله ویژگی‎های متمایز کووید-19 می‎توان به تغییرات عروقی مرتبط با بیماری اشاره نمود. با توجه به تخریب گستردۀ آلوئولار، در عفونت ناشی از کرونا ویروس سندروم تنفسی حاد و کروناویروس سندروم تنفسی حاد2، تشکیل فیبرین لخته شده(fibrin thrombi) مشاهده گردید ولی، بصورت منظم و اصولی مورد مطالعه قرار نگرفته است. از نظر بالینی نیز در بسیاری از بیماران ، سطوح دی‎-دایمر افزایش یافت. همچنین بروز تغییرات‌پوستی شدید در اندام، نشان‏دهندۀ ترومبوتیک میکروآنژیوپاتی است. انعقاد درون‌رگی گسترده (Diffuse intravascular coagulation) و ترومبوز رگ بزرگ (large-vessel thrombosis) با نارسایی اندامی چند سیستمی (multisystem organ failure) در ارتباط است. تغییرات عروقی مربوط به ریه‌های محیطی به خوبی مشخص نشده‎ اند اما، واسکولوپاتی در شبکه‎ های تبادل گاز، مبتنی بر تأثیر آن روی تطبیق ونتیلاسیون و پرفیوژن، می‌تواند بطور بالقوه با هایپوکسمی و تأثیرات حالت بدن (به‎عنوان مثال حالت درازکش-دمر) در هنگام اکسیژن‏ رسانی در ارتباط باشد.

علیرغم تجربه‌های پیشین مرتبط با SARS-CoV و همچنین 2-SARS-CoV، تغییرات مورفولوژیک(ریخت‌شناسی) و مولکولی مرتبط با این عفونت‏ها در ریه‎‌های محیطی به خوبی مستندسازی نشده‎اند. در این پژوهش به بررسی ویژگی‎های مولکولی و مورفولوژیک ریه‏‌ها خواهیم پرداخت. ریه‎‌های بیمارانی که در اثر ابتلا به کووید-19 جان خود را از دست داده بودند کالبدشکافی شد و با ریه‏‌های بیمارانی که در اثر ابتلا به آنفلوآنزا جان خود را از دست داده بودند و همچنین ریه‎‌های غیرعفونی مطابق سن (گروه کنترل) مقایسه شدند.

در این آزمایش هفت ریۀ بدست‎ آمده از کالبدشکافی بیماران فوت ‏شده در اثر کووید-19 باهفت ریۀ بدست‏ آمده از کالبدشکافی بیماران فوت‏ شده در اثر سندروم دیسترس تنفسی حاد(ARDS) ناشی از عفونت آنفلوآنزای(A (N1H1 و 10 ریۀ گروه کنترل (ریه‏های غیرعفونی مطابق با سن) را مورد ارزیابی قرار گفتند. با استفاده از آنالیز ایمونوهیستوشیمی(بافت‌شیمی‌ایمنی) هفت‌رنگ، corrosion casting، تصویربرداری‌میکروسی‎تی(میکروتوموگرافی)،اسکن‌میکروسکوپ‌الکترونی(scanning electron microscopy) ،سنجش مستقیم و چندگانۀ بیان ژن ریه‎ ها مورد مطالعه و بررسی قرار گرفتند. بافت‌شیمی‌ایمنی نام یک فرآیند برای مکان‌یابی پروتئین‌ها در یاخته‌های یک بافت است.

◄ نتایج :

در بیمارانی که در اثر نارسایی تنفسی ناشی از کووید-19 یا نارسایی تنفسی حاصل از آنفلوآنزا درگذشتند، الگوی مربوط به بافت‏ شناسی ریۀ محیطی، تخریب گستردۀ آلوئولار با انفیلتراسیون سلول‌T پیرامون‌رگها( diffuse alveolar damage with perivascular T-cell infiltration ) نشان می‌داد.ریه‏‌های بیماران مبتلا به کووید-19 نیز ویژگی‏های عروقی مشخصی را نشان دادند. این ویژگی شامل جراحت شدید اندوتلیال همراه با وجود ویروس درون سلولی(intracellular virus) و غشای سلولی ازهم گسیخته بود. ارزیابی بافت‎شناسی رگ‎های ریوی در بیماران مبتلا به کووید-19 ترومبوز وسیع با میکروآنژیوپاتی را نشان داد. در بیماران مبتلا به کووید-19 میکروترومبی مویرگی آلوئولار، 9 برابر شایع‎تر از بیماران مبتلا به آنفلوآنزا بود (0/001). در ریه‏‌های گروه کووید-19 میزان رگ‏زایی( بطور عمده ازطریق مکانیسم متابولیسم آنژیوژنز) 7/2 برابر بیشتر از رگ‏زایی در گروه آنفلوآنزا بود(P<0.001).

در تمام نمونه‏‌های ریه‏‌های گروه کووید-19 این نشانه‌ها مشاهده شد: تخریب گستردۀ آلوِئولار همراه با نکروز سلول‎های پوششی آن، هیپرپلازی(hyperplasia)، پنوموسیت نوع 2 و انباشت فیبرین درون‏رگی خطی (شکل 1). تغییرات در 4 مورد از 7 مورد کانونی بود و فقط ادم خفیف بینابینی(mild interstitial edema) مشاهده گردید. در سه نمونۀ باقی‌مانده، انباشت‌(رسوبات) همگن فیبرین(homogeneous fibrin) و اِدم علامتدار بینابین همراه با تشکیلات درون آلوئولار زودرس(marked interstitial edema with early intraalveolar organization) مشاهده گردید.

در نمونه‎‌های گروه آنفلوآنزا تخریب گستردۀ آلوئولار (قرمز رنگ) با ادم بینابینی وسیع و رسوب گستردۀ فیبرین در تمام نمونه‏‌ها مشاهده شد. علاوه بر این در گروه آنفلوآنزا سه مورد از نمونه‏‌ها دارای آرایش کانونی و التهاب جذبی (resorptive) بودند. این تغییرات در ریه‏‌هایی که وزن بالاتری داشتند، در گروه آنفلوآنزا بازتاب بیشتری داشت.

◄ ترومبوز و میکروآنژیوپاتی:

سیستم عروق ریوی ریه‏ های گروه کووید-19 و گروه آنفلوآنزا بااستفاده از روشهایی با نام رنگ‎آمیزی هماتوکسیلین - آئوزین، تری‎کروم و رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی(immunohistochemical staining) تحت ارزیابی قرارگرفتند. آنالیز عروق پیش‎ مویرگی نشان داد که 4 ریه از 7 ریۀ گروه کووید-19 و 4 ریه از 7 ریۀ گروه آنفلوآنزا، ترومبی بصورتی پایدار در سرخرگ ریوی با شعاع 1 تا 2 میلی‎متر وجود دارد و هیچ انسداد لومینال(luminal obstruction) مشاهده نشد. ترومبیِ فیبرین مویرگ‎های آلوئولار را می‌‎توان در ریه‎‌های تمام افراد دو گروه مشاهده نمود (شکل 2). میکروترومبی مویرگی آلوئولار(Alveolar capillary microthrombi) در بیماران گروه کووید-19 ، 9 برابر گروه آنفلوآنزا شایع‌تر بود. ترومبی درون‎ عروقی در ونول‎های پس‎‎ مویرگی(Intravascular thrombi in postcapillary venules ) (با قطر کمتر از 1 میلی‎متر) گروه کووید-19 کمتر از بیماران گروه آنفلوآنزا بود (16±35 vs. 14±12, P=0.02). در مقایسه با چهار ریه از گروه آنفلوآنزا ، دو ریه از گروه کووید-19 تمام بخش‎های سیستم عروقی درگیر بودند. در سه ریۀ گروه کووید-19 و سه ریۀ گروه آنفلوآنزا ترکیبی از ترومبی سیاهرگی و مویرگی بدون ترومبی سرخرگی مشاهده گردید.

یافته‏ های بافت‏شناسی بااستفاده از میکروسی‎‌تی‌‎اسکن سه‏ بعدی نمونه‏‌های ریوی نشان داد که رگ‎های پیش ‎مویرگی و پس‎ مویرگی ریه‏ های بیماران گروه کووید-19 و گروه آنفلوآنزا تقریبابطور کامل مسدود شده‎‌اند.

◄ آنژیوژنز:

ساختار ریزعروقی (Microvascular) ریه‌های بیماران کووید-19 ، بیماران آنفلوآنزایی و گروه کنترل سالم ، توسط میکروسکوپ الکترونی و microvascular corrosion casting مورد ارزیابی قرارگرفت. در روش microvascular corrosion casting با استفاده از ساختار سه‌بعدی، رگهای خونی را در اندام انسان و حیوان شبیه سازی می‌نمایند. در ریه‏‌های گروه کووید-19 ، دارای سیستم عروقی از حالت طبیعی خارج شده و با تغییرشکل (Deform) ساختاری مویرگ‎هاهمراه بود (شکل 3). مویرگ‌های کشیده‌شده (Elongated capillaries) در ریه‏‌های گروه کووید-19 نشانگر تغییر ناگهانی در گنجایش و حضور ستون‎های intussusceptive در داخل مویرگ‎ها بود (شکل 3c). با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (Transmission electron microscopy)، اندوتلیوم گروه کووید-19 نشان‎دهندۀ تخریب فراساختاری اندوتلیوم و همچنین حضور کروناویروسِ سندروم تنفسی حاد2 درون‎‌سلولی بود (شکل 3D). همچنین ویروس می‎تواند در فضای خارج سلولی نیز شناسایی شود.

در ریه‏‌های گروه کووید-19 چگالی درهم‏رفتگی ویژگی‎های آنژیوژنیک (رگ‎زایی) بطور قابل توجهی بزرگ‎تر از چگالی ریه‌‏های گروه آنفلوآنزا ، یا گروه کنترل بود (P<0.001 برای هر دو گروه مقایسه شد) (شکل 4A). چگالی رگ‏زایی ازطریق جوانه‏‌زنی(density of features of conventional sprouting angiogenesis) در گروه کووید-19 بیشتر از گروه آنفلوآنزا بود (شکل 4B). با ترسیم ویژگی آنژیوژنیک (رگ‏زایی) ریوی به‎‌عنوان تابع طول مدت بستری در بیمارستان مشخص شد که با افزایش دورۀ بستری‏شدن در بیمارستان میزان درهم‏روی رگ‏زایی افزایش می‏یابد (P<0.001) (شکل 4c). در مقابل در ریه‏‌های گروه آنفلوآنزا درهم‏روی رگ‏زایی کمتر بود و با گذشت زمان افزایش نیافت (شکل 4C). برای رگ‏زایی ازطریق جوان ه‏زنی الگویی مشابه مشاهده گردید (شکل 4D).

در یک ارزیابی چندگانۀ بیان ژن مربوط به رگ‏زایی به‌وسیلۀ فن‌آوری cCounter Pan Cancer Progression (فن‌آوریهای نانواسترینگ) 323 مورد ژن بررسی شدند. این بررسی نشانگر وجود تفاوت میان نمونه‏‌های بدست‏آمده از گروه کووید-19 و گروه آنفلوآنزا بود. تنها در گروه کووید-19 مجموع 69 ژن و در گروه آنفلوآنزا 26 ژن مربوط به رگ‏زایی بصورت افتراقی تنظیم شدند. 45 ژن دارای تغییرات مشترک در بیان ژن بودند (شکل 5).

◄ نتیجه گیری:

در این نمونۀ کوچک تحت بررسی، رگ‏زایی عروقی(vascular angiogenesis) پاتوبیولوژی ریوی در کووید-19 متمایز از رگ‏زایی عروقی در عفونت ویروسی آنفلوآنزا (با همان شدت کووید-19) است. در هر روی جامعیت و پیچیدگی‎های بالینی مشاهدات و تجربیات پیرامون کووید-19 نیازمند انجام تحقیقات بیشتری است و به طور حتم درآینده به نتایج قابل توجهی خواهیم رسید.

Ref:The New England Journal Of Medicine